柚子是柑橘的三大品种之一。果实积累了影响风味的各种丰富的次生代谢物。UDP-糖基转移酶（UGTs）参与次级代谢物的糖基化。

植物产生多种次生代谢物，这些代谢物在不同发育阶段参与重要机制。糖基化作为重要的修饰反应，通常是植物次生代谢物生物合成的最后一步。糖基化与甲基化、羟基化和酰化协调，有助于植物次生代谢物的多样性和复杂。糖基化是稳定和增强植物中代谢物溶解度的主要机制，从而调节植物信号通路和细胞内稳态。

糖基转移酶催化糖基化。2020年，CAZy数据库共收录了110个糖基转移酶（GT）超级家族，其中GT1家族的基因成员数量最多，主要在植物中。GT1家族通常被称为UDP-糖基转移酶（UGT），因为它主要催化UDP糖向特定受体的转移，包括植物激素、次级代谢物和异生素。

植物UGT在C末端具有44个氨基酸的保守序列，称为植物副产物糖基转移酶盒（PSPG盒），负责糖基的结合[5]。N末端在序列上变化很大，负责识别不同的受体分子。

参与植物次级代谢的UGTs通常表现出广泛的底物特异性。对果实中的糖基化萜类化合物、苯丙类化合物和黄酮类化合物进行了功能表征。

在苹果中鉴定出根皮素特异性糖基转移酶UGT88F1。来自葡萄的VvGT6和VvGT7，来自草莓的FaGT7和FaGT8被鉴定为参与类黄酮的糖基化。AdGT4被鉴定为猕猴桃中的糖基化萜烯醇，而F3GT1参与猕猴桃花青素的生物合成。

在桃果中，PpUGT85A2被鉴定为糖基化萜类化合物和苯丙烷类化合物，PpUGT78A1和PpUGT78A2负责花青素的糖基化。

在柑橘中，已经报道了一些催化类黄酮糖基化的UGT成员，包括来自柚子的Cm1_2RhaT，来自甜橙的CsUGT76F和Cs1，6RhaT，以及其他三种UGTs被认为是推定的萜类糖基转移酶。

迄今为止，许多植物物种已经有了完整且几乎完整的基因组测序程序，为UGT基因家族的全基因组研究提供了基础。已经发现UGT作为多基因家族存在于植物中，并在许多植物物种中得到扩展。

在拟南芥中发现了100多个UGT成员，在其他植物物种中发现了更多的UGT家族成员。例如，在Zea mays ，Triticum aestivum 和Oryza sativa中分别发现了18，19和5个UGT。此外，对于水果，UGT基因家族的全基因组分析也有报道，包括Malus x homea，Vitis vinifera 和Prunus persica 。然而，关于其他水果中UGT的信息仍然有限。

柚子是最重要的经济柑橘品种之一，水果含有特殊的风味，富含类黄酮，对人体健康有益。本研究基于基因组数据库分析，在柚子中鉴定出145个UGT基因成员。对Extron-内含子分析进行了系统发育分析、染色体定位和基因结构分析。

采用RNA-seq分析柚子UGT基因在发育和成熟过程中各果实组织中的表达模式。UGT基因家族的全基因组分析为未来柚子UGT的筛选和功能鉴定提供了见解。

柚子的鉴定

在柚子果实中共有145个UGTs在蛋白质的C末端含有共识序列（PSPG框）。这些UGT基因编码的预测蛋白质范围为144至680个氨基酸（平均459个氨基酸）。

分子量从16.39到76.87kDa（平均Mw = 51.26 kDa）和等电点（pI）的范围从4.82到9.18（平均pI = 5.81）。这些基因的亚细胞定位表明，88个UGT成员（占UGTs的61%）可能在细胞质中，35个（24%）和17个（12%）UGTs最有可能分别在质膜和叶绿体中。

预计只有一个UGT（Cg7g000340）位于线粒体中，两个（Cg6g025740和Cg8g023190）位于细胞核中，两个（Cg3g014800和Cg3g014820）位于细胞外。

柚子UGT的系统发育分析

为了探究植物UGT家族的进化关系，基于柚子和其他植物UGT蛋白序列构建了系统发育树，包括拟南芥、柑橘、玉米、番茄、葡萄、桃、苹果、猕猴桃和草莓。

所有UGT成员被分为16个系统发育组，包括拟南芥中鉴定的14个保守组（A-N），以及在其他植物（如葡萄藤）中发现的两个新发现的O组和P组。

来自柚子的Cm1_2RhaT（100%氨基酸序列同一性为Cg1g023820）和来自甜橙的Cs1，6RhaT被鉴定为类黄酮7-O-UGTs，聚集在A组中。

拟 南 芥UGT76C1（黄酮醇-7-O-鼠李糖苷-7-O-葡萄糖基转移酶）和草莓FaGT73（黄酮醇-6-O-葡萄糖基转移酶）[3]位于D组。其他负责黄酮醇-7-O-糖基化的UGT位于F组，包括来自拟南芥的UGT21D7[3]，以及来自葡萄的VvGT8和VvGT3。

在'瓦伦西亚'甜橙中分离出1个假定的萜类化合物UGT，CsUGT3和CsUGT2聚集在L组，而CsUGT17聚集在D组。几个UGT71（属于D组）和UGT23家族成员（属于E组）在花青素的生物合成和挥发性代谢物的糖基化中起作用。G组中的其他一些UGTs也被功能表征为参与萜类糖基化并影响水果风味，例如猕猴桃AdGT9，葡萄VvGT25和桃子PpUGT2A11。

植物UGT在系统发育群中的分布

通过比较不同系统发育群中UGT的分布，分析了植物UGT基因家族的进化模式。在高等植物的进化过程中，五个系统发育组A，D，E，G和L似乎比其他组扩展得更多，尽管在这些组中发现的基因数量在物种之间差异很大。

在柚子中，六个系统发育组A，D，E，H，I和L比其他组扩展得更多。G组只有9个柚子UGT，多于拟南芥（6个UGT），但比其他植物少得多，特别是桃子和苹果，G组分别有34个和40个UGT。I组中柚子UGT的数量占柚子UGT总数的12%，远高于其他植物。

H组柚子UGTs的比例（约占柚子总数的12%）远高于桃子、苹果和葡萄等其他水果。值得注意的是，通过将每个系统发育组中的植物UGT数量与拟南芥中报告的植物UGT数量进行比较，I组和M组的植物UGT数量显著增加。

在拟南芥中，I组只有5个UGT成员，而其他植物含有17-1个成员，柚子中的UGT数量最多。在M组中，UGTs的数量从拟南芥的7个到桃子的1个不等，拟南芥和柚子之间存在2倍的差异。此外，一些组中柚子UGTs的数量相对于拟南芥减少，包括C组，F组，H组和L组。

UGT基因在柚子中的染色体位置

为总结柚子UGT基因的基因组分布，基于从柚子基因组数据库中检索到的基因组注释信息，研究了UGT基因的染色体位置。共有139个UGT基因不均匀分布在9条染色体的柚子基因组上，其余6个UGT基因定位在未知染色体（chrUn）上，包括K组的CgUng002730、I组的CgUng021570和 D组的2个UGT基因。

在柚子基因组中，23号染色体包含的UGT基因最多（21个成员），其次是位于8号染色体上的20个成员和位于6号染色体上的4个成员。只有五个成员分布在2号染色体上，该染色体包含最少数量的UGT基因。

由于柚子UGTs可以分为16组，因此观察到这些组在染色体上的定位。成员最多的E组UGT基因（25个基因）随机分布在1条染色体（7-9号和3号染色体）上。对于I组，5号和6号染色体各包含8个UGT基因，7号染色体具有2个UGT基因，其余1个成员位于3号染色体和未知染色体上。M组包含2个UGT基因，其中3个位于2号染色体上，1个位于1号染色体上。

柚子中UGT基因的结构分析

为了更好地探究柚子UGT基因结构与功能之间的关系，进一步明确UGT基因家族内部的进化关系，对UGT基因家族内部的进化关系进行了分析。

在145个柚子UGT基因中，70个UGTs（48%）没有内含子，63个UGTs（43%）含有2个内含子，其余2个UGT含有22个内含子，15个UGT含有13个内含子，只有14个 UGT含有17个内含子。

对于UGT组，E组包含的丢失内含子的基因数量最多，其次是D组的2个和A组的1个。B组，C组和O组的所有成员都没有内含子。H组和I组中的大多数UGT包含一个内含子，每组所有成员中有3个UGT。

在搜索所有75个含内含子序列并将内含子映射到氨基酸序列后，在柚子UGT基因家族成员中观察到10个独立的内含子插入事件。 根据蛋白质序列中的位置，这些插入事件从I-1到I-10依次编号。内含子5（I-5）被认为是保守性最高的内含子，是UGTs中分布最广的内含子，含有48个UGT成员（64%的内含子含有UGTs），除了E组，L族和M族。

F、K、J、N和P组的所有成员，以及G、H和I组的大多数成员都含有内含子5。G组5个UGT中共有13个含有内含子17，I组12个中有17个，H组6个中有2个，L组主要观察到内含子。

在柚子的UGT基因结构中鉴定出的96个内含子中，大多数处于1期，占64%（61个内含子），其次是28期的27%（0个内含子），第二阶段只有8%（8个内含子）。对于高度保守的内含子4，5期和0期各有一个内含子，而2期占所有内含子的1%。

内含子 96 和 4 的所有成员中含有 7 个内含子 9 的 UGT 都处于 6 期。这些发现表明，大多数高保守内含子是古代元素，它们的相在进化过程中保持稳定。

发育和成熟过程中不同果实组织中的表达曲线

为检测145个柚子UGT基因的表达谱，采用RNA-seq数据分析了发育和成熟过程中不同果实组织中UGTs的转录丰度。柚子果实5种不同组织分别为黄素、反照率、节段膜（SM）和汁囊（JS）。

84个果实组织中共表达1个UGT基因（占柚子总基因的4.3%）。此外，2个UGT基因（占3%）、0个UGT基因（8.5%）和2个UGT基因分别在JS、SM和黄素中特异性表达，但没有基因在反照率中特异性表达。

对于处于不同发育阶段的柚果，近一半（71个成员）的UGT基因在黄果中显示出最高水平的转录本。其中，13名UGT（52%）属于E组，10名UGT（占D组成员的56%）属于D组，8名UGT（占D组成员的47%）属于H组，9名UGT（占53%）属于I组，7名UGT（占D组成员的58%）属于L组。

柚子中29个成员的表达量在绿色期最高（80 DAB），其次是断色期的23个成员（140 DAB），成熟期的表达量为19个（200 DAB）。A组Cg1g023820与柚子Cm100_1RhaT氨基酸序列2%一致，被鉴定为黄酮类化合物7-O-UGT，在柚果黄果变色期（140 DAB）和成熟期（200 DAB）的转录本水平最高。

这一发现与之前的研究一致。考虑到E组柚子UGT基因数量最多，进一步分析了发育和成熟过程中不同果实组织中的表达模式。共有80个UGT基因在黄素绿期（2 DAB）显示转录丰度最高，黄素果显色期037190个基因，成熟期3个基因。

只有一个UGT基因Cg022390g6在反照率破色期和成熟期表达最高，而Cg012170g和Cg>g两个基因在柚果实节段膜（SM）中的表达水平最高，基因主要在汁囊（JS）中表达。

植物糖基转移酶属于一个大型且功能多样化的酶家族，其特征为糖基转移酶家族1，也称为UDP-糖基转移酶（UGT）。植物UGTs催化多种底物用于糖基化反应，包括植物激素，植物次生代谢物和生物均质/异源物质（如氰苷和除草剂）。

植物次生代谢产物一般分为三类：酚类、萜烯类和含氮有机化合物。其中一些化合物经过化学修饰，糖基化是重要的修饰反应之一。几种UGT基因已在植物中进行了功能表征，例如拟南芥，Zea mays ，小麦，芸苔属和Prunus persica。

在柑橘中，只有1个UGTs被功能鉴定出来，Cm2_1RhaT来自柚子，Cs6，76RhaT和CsUGT1F13来自与类黄酮糖基化相关的甜橙，以及2个推定的萜类化合物UGTs，CsUGT3，CsUGT17和CsUG。然而，在柑橘中没有发现大规模的分析。

本研究共鉴定出柚果145个UGT基因，约占柚子基因产物的0.5%，低于桃子的0.6%。柚子UGT基因被聚集成为16组，包括14个高度保守的组（A-N）和1个新发现的O和P组。

仅在玉米和小麦中发现了一个新的Q群，表明该群可能仅存在于单子叶植物中，并在单子叶植物的UGT基因进化中起重要作用。相比之下，K组在玉米和水稻中只有一个UGT成员，在小麦中没有成员，这意味着K组可能在双子叶植物中扩展成员。

在柚子组N中仅鉴定出一个成员，这与拟南芥、苹果和桃子等双子叶植物相同。这一发现为先前的推测提供了额外的证据，即N族主要在单子叶植物中扩增。此外，E组含有最多的UGT基因，占柚子中所有UGT基因的6%。

此外，与本研究相比，E组UGT基因在23种植物中占比最高，表明E组在多种植物中均已扩增。此外，许多属于E组的植物UGT基因成员已被功能鉴定，包括小分子挥发性化合物的糖基化，以及黄酮类糖苷、根皮苷和花青素的合成，这表明E组对植物次生代谢物的糖基化做出了重要贡献。

结果

在本研究中，我们对柚子UGT家族进行了全基因组分析，基于保守的植物副产物糖基转移酶（PSPG）基序共鉴定了145个UGT。通过对这些基因与其他植物UGTs（A-P）的系统发育分析，将这些UGT基因聚集成16个主要组。柚子UGTs在染色体间分布不均匀。

在这些UGT基因组序列中观察到至少10个内含子插入事件，I-5被确定为保守程度最高的事件。采用RNA-seq对柚子UGT基因在不同果实组织中发育和成熟过程中的表达谱进行分析。