层析、电泳与蛋白质分子量测定（蛋白电泳及定量分析实验报告）

蛋白质的分子量可以通过多种方法进行测定，比如元素分析、渗透压、沉降分析、分子筛层析和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）等。

通过元素分析可以测定出蛋白质中某种成分的质量百分含量。如果知道这种成分在蛋白质中的准确数量，就可以计算出蛋白质的分子量。不过对于未知蛋白，一般只能计算出最低分子量。也可以测定多种成分的含量，或结合其它方法来计算真实分子量。

渗透压也可以用来测定分子量。在理想溶液中，渗透压与溶质形状无关，是浓度的线性函数。所以当蛋白质浓度较低时，可用渗透压计算蛋白质的分子量：

M=RT/lim(Π/C)

公式中R是气体常数(0.082)，T是绝对温度，Π是渗透压（单位是大气压），C是浓度（单位是g/L）。测定不同浓度下的渗透压，以Π/C对C作图，外推求出蛋白浓度为零时的Π/C值，即可计算出分子量。此方法简单准确，但要求样品均一，否则测定的是样品中所有蛋白的平均分子量。

沉降分析法测定分子量需要高速离心机，且耗时较长，所以一般很少采用。生物实验室中采用分子筛层析和SDS-PAGE较多。

在分子筛（凝胶过滤）层析中，小分子物质可进入凝胶颗粒的孔洞中，流经路程长，所以流出慢；大分子不能进入凝胶，所以流经路程短，流出快。在一定范围内，蛋白质流出的速度与分子量的对数呈线性关系，可以根据下面公式计算：

lgM＝K₁－K₂ Ve

公式中Ve是洗脱体积，即从加样到出峰时流出的体积，K₁和K₂是常数，随实验条件而定。测定分子量时，先用标准蛋白测定出一条标准曲线，再根据目的蛋白的洗脱体积计算分子量。

因为蛋白质能否进入凝胶与其分子形状有关，所以标准蛋白的分子形状应与待测蛋白相同。此方法一般用于测定球状蛋白的分子量。

SDS-PAGE法可以排除蛋白质分子形状和所带电荷的干扰。原因在于加入的SDS可以使蛋白全都变成棒状，并掩盖原有电荷。据测定，平均每克蛋白可结合1.4克SDS，即每两个残基结合一个SDS。所以大量的负电荷将蛋白原有电荷完全掩盖。

这样，电泳的相对迁移率μ与分子量M的关系如下：

lgM=K₁－K₂ μ

其中K₁和K₂是与实验条件有关的常数。用已知分子量的标准蛋白作标准曲线，即可求出未知蛋白的分子量。在不需要精确定量时，也可以根据目标蛋白与marker（标准蛋白）的相对位置估计分子量大小。

SDS-PAGE法是实验室中最常用的方法，但有些蛋白不适用。比如带电荷较多的组蛋白，其自身电荷难以完全掩盖；带有较大辅基的糖蛋白和结构特殊的胶原蛋白等则不能完全变为棒状结构，所以用普通的标准蛋白来测定会有偏差。

有些同学对分子筛和SDS-PAGE的区别不太理解，这里解释一下。凝胶过滤（分子筛）层析中，凝胶是很多小珠子，珠子有孔。蛋白质可进入过孔中，也可以不进去，直接从凝胶珠的外面走。所以分子量小的蛋白进入凝胶的几率大，就多走了路，层析速度慢。SDS-PAGE的凝胶是一整块，样品只能从孔（网格）里走。所以分子越大，阻力就越大，电泳速度越慢。